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      湖南凱達
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      在凱達高速冷凍離心機用硫氰酸胍離心法提取RNA

      發布時間:2020-09-15 14:52:31

        用硫氰酸胍法取代酚/氯仿/異戍醇-乙醇法提取RNA,該方法是用高濃度的硫氰酸胍裂解純化的細胞核,它是離液序列高的試劑,解離核酸蛋白質復合物,并在破碎過程中使細胞內核酸酶快速失活,然后通過稠密的CsCI墊層阻止DNA和蛋白質沉降,最后用脲-LiCI純化回收RNA,該法也適合于從細菌、植物、動物組織里抽提RNA。本方法由Glisin等(1974)、Chirgwin等(1979)和Auffrag與Roageon(1980)等人建立和發展。

        a. 把細胞核懸浮在5mol/L硫氰酸觚、5mmol/L  Tris-HCl、50mmol/LEDTA、5%(體積分數)2-巰基乙醇(PH=7.0)中,細胞核濃度為(1~5)×107個/mL。

        b. 通過超聲處理剪切DNA,使其分子量降低。

        c. 加固體N-月桂酰(十二酰)肌氨酸鈉到2%(質量濃度),當溶解肌氨酸時,把溶液在50℃加熱2min。

        d. 給高速離心機水平轉子的離心管里加5.7mol/L  CsCl、50mmol/L  EDTA(PH=7.0),再把含RNA溶液鋪放在CsC1墊層上。CsC1墊層的體積是硫氰酸胍溶液的0.25倍。

        e. 在15℃高速離心24~48h,RNA形成沉淀,而蛋白質和DNA分布在溶液里,如下圖所示。

        在5.7mol/L  CsCL上的細胞核(或整細胞)硫氰酸胍裂解物經高速水平轉子離心后內容物分布圖解如下圖所示。

        CsC1屏障法分離RNA

        f. 用吸管吸出上清液直到DNA帶(可以用透射折射和黏度來判斷),倒出剩余溶液,把離心管顛倒放在棉紙上,使之徹底排于,以減少DNA對RNA的污染。

        g. 從離心管底部0.5~1.0cm高度處把離心管切掉(把DNA區帶占據的位置切掉),把干凈的凝膠狀RNA沉淀用1~2mL的滅菌水洗出。

        h. 加入1/9體積的滅菌3mol/L 乙酸鈉(PH=7.0)、2.5倍體積的乙醇。放置于-20℃過夜使RNA沉淀。

        i. 在0℃、最大16000g離心10min收集RNA(凱達KH20R-Ⅱ高速冷凍離心機10000r/min),并重新懸浮在70%(體積分數)乙醇里洗沉淀,然后用95%乙醇洗(每次使用離心機的離心的條件都是一樣的),再在真空干燥器里或再用干燥氮氣使RNA干燥。

        j. 除去殘留在RNA里的微量DNA是把沉淀重新溶解在0.5mL的滅菌水里,與0.5mL 8mol/L脲、4mol/L LiCI(PH=7.0)混合,混合物在4℃過液,通過離心收集RNA沉淀,按步驟i清洗和干燥。

        k. 把RNA沉淀重新懸浮在0.3mol/L乙酸鈉(PH=7.0)里,再加2.5倍體積的乙醇-20℃過夜,收集RNA沉淀,按步驟i清洗和干燥。

        l. RNA可以脫水儲存于-20℃,或者溶解在滅菌水里,分成小份儲存于-20℃。

        至此,完成了使用凱達離心機對RNA的離心分離提取。